Ein in vitro Bioassay für den Nachweis von Dioxinen in Lebensmitteln und der routinemäßige Einsatz im Hessischen Landeslabor

Titelbild Winkler.JPG

Aufwuchs und mikroskopische Kontrolle von Rattenleberzellen
Aufwuchs und mikroskopische Kontrolle von Rattenleberzellen

Dioxine, Furane und dioxinähnliche polychlorierte Biphenyle (dl-PCB) gehören zu einer Gruppe besonders toxischer und langlebiger Umweltschadstoffe. Diese Schadstoffe entstehen als Nebenprodukte bei der Herstellung chlororganischer Verbindungen oder bei der Verbrennung chlorhaltiger organischer Materialien (Abb. 1). Im Vergleich hierzu wurden dl-PCB in der Vergangenheit als sogenannte „technische Gemische“ für Kunststoffe, als Wärmetauscher in Transformatoren, als Dielektrikum in Kondensatoren, sowie Lacken, Fugendichtungen und Hydraulikflüssigkeiten, beigemischt. Über die mannigfaltigen Herstellungsprozesse und Einsatzgebiete gelangten in der Vergangenheit größere Mengen von Dioxinen, Furanen und dl-PCB in die Umwelt und in die Nahrungsketten. Aufgrund ihrer guten Fettlöslichkeit und ihrer Langlebigkeit reichern sich diese Gifte bis heute bevorzugt im Fettgewebe von Organismen am Ende der Nahrungskette an. Einige Verbindungen dieser Stoffklassen können im Tierversuch bereits in sehr geringen Konzentration ein breites Spektrum gesundheitsschädlicher Wirkungen entfalten.

Überwiegend aus der Vergangenheit herrührende Kontaminationsquellen für Dioxine, Furane und dl-PCB
Abb.1: Überwiegend aus der Vergangenheit herrührende Kontaminationsquellen für Dioxine, Furane und dl-PCB

Um welche Stoffklassen handelt es sich?

Abbildungen 2.1 bis 2.3 zeigen die chemischen Grundstrukturen der 3 Stoffgruppen, welche mit dem Bioassay detektiert werden. Prinzipiell reagiert ein Zellrezeptor im Zellinneren mit allen polycyclischen Kohlenwasserstoffen. Hierbei binden chlorhaltigen Dioxine, Furane und dl-PCB mit der höchsten Toxizität besonders effektiv.

Polychlorierte Dioxine (PCDD)
Abb. 2.1: Polychlorierte Dioxine (PCDD)
Polychlorierte Furane (PCDF)
Abb. 2.2: Polychlorierte Furane (PCDF)
Polychlorierte Biphenyle (PCB)
Abb. 2.3: Polychlorierte Biphenyle (PCB)

Abb. 2.1 bis 2.3: Allgemeine Strukturformeln chlorierter Dioxine, Furane und PCB

Die Funktionsweise des „Dioxin-Bioassays“

Die hier vorgestellte Methode verfolgt, unter Verwendung eines zellbasierten in vitro Bioassays (Murk et al. 1996), den Ansatz einer „wirkungsbezogenen Analytik“. Im Gegensatz zur chemischen Analytik, welche die Konzentration einer Substanz bestimmt, wird der Effekt einer Probe auf biologische Zielstrukturen in seiner Gesamtheit ermittelt und damit die Wirkung des gesamten „Dioxin-, Furan- oder PCB-Cocktails“ erfasst. Das molekulare Reaktionsprinzip des Assays verläuft über einen spezifischen Rezeptor im Zellinnern, welcher u.a. mit Dioxinen, Furanen und PCB eine Bindung eingeht und anschließend über eine komplexe Signalkette die Bildung des Glühwürmchenenzyms, Luciferase induziert (Abb. 3). Hierbei korreliert die biologische Antwort, bzw. die Toxizität einer chemischen Verbindung, mit der Bindungsstärke zum Rezeptor und der hierdurch gebildeten Menge des Glühwürmchenenzyms. Die Aktivität des Enzyms, dargestellt durch Biolumineszenz, wird anschließend in einem Messgerät, einem sogenannten Luminometer, bestimmt.

Molekulares Wirkprinzip des „Dioxin Bioassays“
Abb. 3: Molekulares Wirkprinzip des „Dioxin Bioassays“

Legende: AhR = Aryl hydrocarbon Receptor, HSP = Heat shock protein, ARNT = Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator, dl-PCB = Dioxinähnliche polychlorierte Biphenyle, Rat H4IIE = Genetisch veränderte Rattenleberzellen. Umweltgifte wie Dioxine, Furane und dl-PCB werden von den Zellen aufgenommen und führen über eine Signalkette zur Bildung des Glühwürmchenenzyms, Luciferase. Durch Zugabe von Luciferin, dem Substrat des Enzyms, beginnt der Zellextrakt zu lumineszieren. Die Konzentration der Umweltgifte korreliert mit der Stärke der Lumineszenz.

Durchführung des Bioassays

Zunächst werden die Fette, in welchen sich die Dioxine, Furane und PCB bevorzugt anreichern, aus den Lebensmitteln herausextrahiert und über eine Kieselgelsäule angereichert (Abb. 4). Nach weiteren Aufarbeitungsschritten werden die konzentrierten Extrakte auf eine Kultur von genetisch veränderten Rattenleberzellen gegeben, welche in der Lage sind, bei Kontakt mit Umweltgiften wie den Dioxinen, das Glühwürmchenenzym Luciferase, zu bilden. Zuletzt werden die Leberzellen zerstört und das Glühwürmchenenzym aus den Zellen freigesetzt. Durch Zugabe von Luciferin, dem enzymspezifischen Substrat, beginnt der Extrakt zu leuchten. Die Intensität dieser Lumineszenz ist proportional zu den Konzentrationen der gesundheitsschädlichen Dioxine, Furane und dl-PCB.

Methodischer Ablauf des „Dioxin-Bioassays“
Abb. 4: Methodischer Ablauf des „Dioxin-Bioassays“

Einsatz des Bioassays für sichere Lebensmittel

Für die Dioxinanalytik in Lebens- und Futtermitteln existiert ein EU-weit gültiges Regelwerk, welches die Untersuchungen dieser gesundheitsschädlichen Substanzen festlegt. Da der Großteil der Lebensmittel in Bezug auf ihre Dioxingehalte unkritisch ist, bietet sich der Bioassay als vergleichsweise schnelles Verfahren für die Erstuntersuchung von Proben an. Lediglich ein geringer Prozentsatz von Proben, mit auffällig hohen Gehalten, wird anschließend zur Absicherung mit aufwendigen und teuren chemisch-analytischen Verfahren, nachuntersucht. Da mit einem Bioassay auch weitere dioxinähnliche Verbindungen wie z.B. Brom- oder Stickstoffhaltige Dioxinanaloge ohne zusätzlichen Aufwand erfasst werden, können bei unauffälligen Lebensmittelproben auch diese, für den Menschen gesundheitsschädliche Stoffe, ausgeschlossen werden.

Eine Kombination aus dem hier vorgestellten „Dioxin-Bioassay“ und aufwendiger, chemischen Analytik, ermöglicht einen deutlich höheren Probendurchsatz und im Hinblick auf zukünftige Dioxinkrisen eine schnellere Ursachenaufklärung und bedeutet daher mehr Sicherheit für den Verbraucher (Winkler, 2014 und 2015).

Referenzen

Murk AJ, Legler J, Denison MS, Giesy JP, van de Guchte C, Brouwer A. Chemical- activated luciferase gene expression (CALUX): a novel in vitro bioassay for Ah receptor active compounds in sediments and pore water. Fundam.  Appl. Toxicol. 1996; 33:149-60.

Winkler J. High levels of dioxin-like PCBs found in organic-farmed eggs caused by coating materials of asbestos-cement fiber plates: a case study. Environ. Int. 2015; 80: 72-78.

Winkler J. Nachweis von Dioxinen und dioxinähnlichen Verbindungen in Lebensmitteln mit dem DR-CALUX®-Bioassay. 43. Deutscher Lebensmittelchemikertag, September 2014, Gießen.